Pole magnetyczne, białka stresu oraz teratogeneza 1

Ryszard Jelinek
Charles University, Trzeci Wydział Medycyny
Ruska 87 CZ-100 00 Praga 10 (Republika Czeska)

Streszczenie: Stymulacja za pomocą pola magnetycznego przed zadziałaniem impulsu teratogennego może zapewnić ochronę zarodkom kurzym przeciwko potencjalnym objawom embriotoksyczności. Kilka prac, przeprowadzonych w ciągu ostatnich 10 lat wykazało, że zastosowanie krótko-okresowego, słabego pola elektromagnetycznego o niskiej częstotliwości może wywierać ochronne działanie na zarodki kurze przed szkodliwym wpływem światła ultrafioletowego (Dicarlo i wsp. 1999), promieniowania jonizującego, rentgenowskiego (Pafkova, Jerabek, 1994) jak i przed uszkadzającym działaniem teratogennym różnych substancji chemicznych (Pafkova i wsp. 1996). Mechanizm tego działania ochronnego pozostawał w znacznym stopniu niewyjaśniony, aż do czasu, gdy wykazano obecność domeny reagującej na działanie pola magnetycznego w promotorze ludzkiego białka szoku cieplnego (heat shock protein - HSP 70) (Lin i wsp. 1999). Ponieważ daje to podstawy do wytłumaczenia korzystnego wpływu terapeutycznego pola magnetycznego BEMER (np. w wyniku indukcji białek szoku cieplnego działających ochronnie na żywe komórki przed różnego rodzaju uszkodzeniami), w celu zbadania mechanizmu działania pola magnetycznego BEMER opracowano specjalny model doświadczalny. Jest to dobrze znany i łatwo dostępny model biologiczny - model zarodka kurczaka w warunkach bardzo dokładnie kontrolowanej ekspozycji na działanie pola magnetycznego. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie opisu modelu doświadczalnego oraz wyników wstępnych doświadczeń.

Słowa kluczowe: pole magnetyczne, białka stresu i teratogeneza.

Wprowadzenie

Kilka prac, przeprowadzonych w ciągu ostatnich 10 lat wykazało, że zastosowanie krótko-okresowego, słabego pola elektromagnetycznego o niskiej częstotliwości może wywierać ochronne działanie na zarodki kurze przed szkodliwym wpływem światła ultrafioletowego,4 promieniowania jonizującego, rentgenowskiego17 jak i przed uszkadzającym działaniem teratogennym różnych substancji chemicznych.18 Mechanizm tego działania ochronnego pozostawał w znacznym stopniu niewyjaśniony, aż do czasu, gdy wykazano obecność domeny reagującej na działanie pola magnetycznego w promotorze ludzkiego białka szoku cieplnego (heat shock protein - HSP 70).13 Ponieważ daje to podstawy do wytłumaczenia korzystnego wpływu terapeutycznego pola magnetycznego BEMER20 (np. w wyniku indukcji białek szoku cieplnego działających ochronnie na żywe komórki przed różnego rodzaju uszkodzeniami), w celu zbadania mechanizmu działania pola magnetycznego BEMER opracowano specjalny model doświadczalny. Jest to dobrze znany i łatwo dostępny model biologiczny - model zarodka kurczaka w warunkach bardzo dokładnie kontrolowanej ekspozycji na działanie pola magnetycznego. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie opisu modelu doświadczalnego oraz wyników wstępnych doświadczeń.

Białka stresu i ich właściwości

U wszystkich organizmów żywych w odpowiedzi na reakcje stresowe dochodzi do indukcji syntezy kilku polipeptydów. Ponieważ odkrycia tego dokonano w związku ze zjawiskiem hipertermii, opisywane peptydy zostały nazwane białkami szoku cieplnego (hsps). Wyszliśmy z założenia, że białka te są w pewien sposób związane z nieprawidłowym rozwojem zarodków kurzych. Wkrótce stało się oczywistym, że zwiększenie produkcji hsps może być indukowane przez szereg różnych czynników środowiskowych, w tym substancji chemicznych oraz wirusów. Białka ostrej fazy znajdywano we wszystkich komórkach, eksponowanych na różne czynniki stresowe, niezależnie od badanego gatunku. Białka hsps współdziałają we wnętrzu komórek z polipeptydami chroniąc je przed nieprawidłową denaturacją. Krótko mówiąc, spełniają one rolę bardzo skutecznych wewnątrzkomórkowych opiekunów. W zależności od wielkości wyróżniamy pięć głównych klas tych białek:

Hsp 110 Białko to znajduje się w jądrze komórkowym i produkowane jest jedynie przez komórki ssaków. Sugerowano, że hsp 110 może odgrywać pewną rolą w odnowie aktywności jądra komórkowego.

Hsp 90 Białko to związane jest z receptorami hormonalnymi oraz z co najmniej dwoma białkami związanymi z glukozą. Białko to wywiera głównie działanie ochronne poprzez różnorodne typy interakcji z białkami, które nie wymagają hydrolizy ATP. Jest ono obecne także w komórkach nie eksponowanych na czynniki stresowe, jednakże jego stężenie może wzrosnąć nawet pięciokrotnie w wyniku zadziałania stresu cieplnego. Hsp 90 współdziała z niektórymi receptorami dla hormonów steroidowych i kinazami białkowymi.

Hsp 70 W skład rodziny hsp 70 wchodzi 21 białek. Jedno z tych białek - HSP 73 jest jednym z genów, do którego ekspresji dochodzi na wczesnym etapie zarodkowym w czasie aktywacji genomu zygoty.14 Inne białko z tej grupy - HSP 72 w zwiększa swoją ekspresję w warunkach stresu oraz w odpowiedzi na transfekcję onkogenów takich jak c-myc.

Hsps o średniej masie cząsteczkowej Do ich ekspresji na niewielkim poziomie dochodzi w mitochondriach i błonach komórkowych w warunkach nieobecności czynników stresowych.

Hsps o niskiej masie cząsteczkowej Tworzą różnorodną grupę, włączając oksygenazę hemu, statminę oraz mały polipeptyd - ubikwitynę (8 kDa), białka odgrywające rolę w nie lizosomalnym procesie usuwania agregatów zdenaturowanych białek.

Ostatnio, zidentyfikowano czynnik wczesno-ciążowy (early pregnancy factor (EPF), który jest homologiem chaperoniny 10 z czynnikiem immunosupresyjnym i czynnikiem wzrostu. W ten sposób substancja ta również zaliczana jest do rodziny białek hsp, jednakże w przeciwieństwie do pozostałych białek z tej rodziny, EPF wykrywany jest zewnątrzkomórkowo.15 Teraz wydaje się jasnym, że białka hsps zwiększają swoją ekspresję, względnie ich produkcja rośnie w odpowiedzi na szereg różnych czynników jak: hipertermia, wolne rodniki tlenowe, metale ciężkie, etanol, analogi aminokwasów, proces zapalny czy infekcja oraz że białka te są zaangażowane w liczne procesy ważne dla funkcjonowania komórek.16 Z tego powodu zamiast nazwy białka szoku cieplnego powinno się je raczej nazywać białkami stresowymi.

Indukcja białek stresu przez pole elektromagnetyczne

Ogólnie uważa się, że pole elektromagnetyczne w pierwszej kolejności oddziałuje na błony komórkowe, szczególnie zaś na transdukcję sygnału elektromagnetycznego w sodowo-potasowej ATP-azie błony komórkowej. Ten mechanizm działania może jednak nie być jedynym.1 Okazało się, że pole elektromagnetyczne stymuluje transkrypcję DNA bezpośrednio w określonych miejscach (loci), np. w regionie regulującym genu c-fos.19 Należy jednak podkreślić, że podczas gdy pole magnetyczne przenika przez organizm bez żadnej szkody dla niego, natężenie pola elektrycznego redukowane jest co najmniej do jednej milionowej części wyjściowego natężenia, tak że ledwo może przebić się przez naturalne pola elektryczne indukowane przez fluktuacje termalne.3 Z tego powodu wydaje się słuszne, aby skoncentrować się jedynie na działaniu pola magnetycznego. Stymulacja polem magnetycznym o częstotliwości 60 Hz powoduje aktywację czynnika szoku cieplnego 1 oraz związanie cząsteczki białka szoku cieplnego co skutkuje transkrypcją genu stresu HSP 70 i syntezą białka hsp 70.11 Po przeprowadzeniu badań dotyczących miejsc wiązania białka c-myc na promotorze HSP 70, Lin i wsp. doszli do wniosku, że podwyższony, endogenny poziom białka myc może wpływać na indukcję syntezy białka hsp 70 w odpowiedzi na stymulację polem magnetycznym.12 Systematyczne badania, przeprowadzane przez tą grupę roboczą doprowadziły w efekcie do odkrycia domeny reagującej na pole magnetyczne w ludzkim promotorze HSP 70.

Pomiędzy ekspresją genu HSP 70 indukowaną działaniem pola magnetycznego i szoku cieplnego istnieją wyraźne i bardzo istotne różnice:

1. Odpowiedź stresowa indukowana jest przez pole magnetyczne o energii 14-krotnie mniejszej od energii cieplnej, koniecznej do jej wywołania.5

2. Stymulacja polem elektromagnetycznym nie hamuje normalnej komórkowej syntezy białek.6,2

W oparciu o powyższe wyniki, możemy przyjąć, że przynajmniej po części korzystne działanie systemu BEMER spowodowane jest indukcją białek stresowych. Hipoteza ta jednak, musi zostać zweryfikowana. Ostatnie zdania oznaczają, że pole magnetyczne BEMER nie powoduje żadnych szkód dla normalnego, zdrowego organizmu, a jedynie poprawia funkcjonowanie wyczerpanych, uszkodzonych lub chorych tkanek, co wykazano w badaniach klinicznych.

Doświadczenie

W celu zweryfikowania powyższej hipotezy, podjęliśmy decyzję, aby opracować taki model doświadczalny, który umożliwi zbadanie mechanizmu działania pola magnetycznego BEMER na różne poziomy bioorganizacji. Wymaga to wykorzystania czułego, łatwo poddającego się kontroli organizmu z możliwością łatwo definiowalnych ekspozycji oraz uszkodzeń oraz szerokiego zakresu jednoznacznych punktów końcowych. Rozwijający się kurczak spełnia wszystkie te wymagania. Podstawowe zadania techniczne przedstawione są poniżej:

1. Skonstruowanie dwóch inkubatorów referencyjnych – jeden umieszczony w standardowym polu magnetycznym, drugi w polu magnetycznym systemu BEMER.

2. Opracowanie komputerowo sterowanego systemu regulacji temperatury dla obu inkubatorów o stałej temperaturze w zakresie 37,5 +/- 0,2 stopnia Celsjusza.

Dla celów doświadczenia skonstruowano dwa inkubatory z systemem gorącego powietrza. Zastosowanie powietrznego systemu ogrzewania umożliwiło uzyskanie w całości nie magnetycznej konstrukcji, dzięki czemu naturalne pole magnetyczne inkubatorów było bardzo słabe. Opracowano również specjalny algorytm przewidywania do celów kontroli i regulacji temperatury w celu osiągnięcia bardzo dużej precyzji oraz stabilności. System umożliwił jednoczesne prowadzenie doświadczenia na grupie doświadczalnej i kontrolnej, gwarantując uzyskanie wiarygodnych i powtarzalnych wyników.

Wykorzystano świeżo zniesione jaja pochodzące od kur z gatunku White Leghorn Fowl zakupione od Instytutu Genetyki Molekularnej Akademii Nauk Republiki Czeskiej. Doświadczenie składało się z dwóch faz. W fazie pierwszej (0-4 dnia) doświadczalną grupę (Experimental - E) 45 jaj poddano działaniu pola magnetycznego BEMER 2000® (stopień 10,3 x 20 minut na dobę, w odstępach ośmiogodzinnych). Grupę kontrolną (Control – C) w takiej samej liczbie inkubowano bez ekspozycji na działanie pola magnetycznego. Czwartego dnia jaja zostały otwarte przy pomocy konwencjonalnej techniki okienkowej (patrz np. 8). Przy pomocy mikroskopu preparacyjnego marki Olympus, zarodki zostały zbadane pod kątem prawidłowości rozwoju oraz ocenione w skali Hamburgera i Hamiltona (HH).7 Poprzez porównanie liczby martwych lub nieprawidłowych zarodków w każdej z grup oraz porównanie punktacji w skali HH, oceniliśmy wpływ pola magnetycznego BEMER na inkubacje w czasie pierwszych 96 godzin. W tym momencie ruszyła druga faza badania, w której ocenialiśmy konsekwencje podania substancji teratogennych zarodkom kurzym z obu badanych grup. Jako substancję teratogenną wybraliśmy cyklofosfamid (Endoksan®, ASTA Medica AG, Frankfurt, Niemcy) po uprzednim określeniu zależnością między standardową dawką a reakcją organizmu. W pierwszym doświadczeniu, przy pomocy specjalnej szklanej kaniuli wszystkim zarodkom kurzym z obu grup wstrzyknęliśmy doowodniowo po 2 mg czystej substancji. Po przemyciu rejonu naczyniowego 0,7% solą fizjologiczną oraz zamknięciu okienka w skorupce za pomocą płytek szklanych i parafiny, jaja zostały z powrotem odłożone do odpowiednich inkubatorów. Po upływie kolejnych 5 dni inkubacji, zarodki były badane przez okna oraz przeźroczyste ściany inkubatorów. Martwe zarodki usuwano, badano pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem widocznych nieprawidłowości w budowie oraz prawdopodobnej przyczyny zgonu a wyniki zapisywano. Dziewiątego dnia inkubacji jaja były ponownie otwierane, zarodki były usuwane, ważone i badane pod kątem nieprawidłowości dotyczących następujących układów i narządów: ośrodkowego układu nerwowego, oczu, twarzy, kończyn, ściany ciała oraz klatki piersiowej. Rutynowe wycięcie serca umożliwiło nam wykrycie wad dużych naczyń oraz przegrody serca. Do celów oceny wyników zastosowano oprogramowanie STATISTICA® (Statsoft), które oprócz analizy opisowej oraz t-testu bazowało na analizie tabeli przypadkowości (contingency table) oraz na analizie wielokrotnej regresji.

Wstępne wyniki

Wyniki pierwszego doświadczenia są przedstawione w sposób synoptyczny na dwóch wykresach. Pierwszy wykres (B-001a) odpowiada fazie pierwszej tj. porównaniu zarodków eksponowanych i nie eksponowanych na działanie pola magnetycznego BEMER w czwartym dniu (przed rozpoczęciem podawania cyklofosfamidu), na drugim wykresie (B-001b) przedstawiono wyniki porównania obu grup w 9 dniu doświadczenia (5 dni po podaniu cyklofosfamidu – faza II).

Zastosowane skróty:
N – całkowita liczba jaj
0 – nie zapłodnione jaja lub wczesna śmierć zarodków
N - normalne (zdrowe) zarodki
D - martwe zarodki

Zmiany narządowe u tych zarodków, które przeżyły:

CNS - ośrodkowy układ nerwowy
BW - ściana ciała
C - grupa kontrolna
E - grupa doświadczalna

Jest oczywistym, że nie stwierdza się różnic statystycznie znamiennych między obydwiema grupami - kontrolną i doświadczalną w obu przypadkach. Ani częstość występowania nieprawidłowości w budowie w grupie zarodków eksponowanych na działanie pola magnetycznego BEMER w pierwszej fazie doświadczenia nie przekroczyła spodziewanej wartości10 ani też ogólny wpływ działania podprogowej dawki cyklofosfamidu nie różnił się w grupie doświadczalnej i kontrolnej (faza II)

Wnioski:

1. Zaprojektowany model doświadczalny okazał się właściwym do badania wpływu pola magnetycznego BEMER na rozwój organizmu.
2. W doświadczeniu wstępnym nie wykazano szkodliwego działania pola magnetycznego BEMER na rozwój zarodka w najbardziej wrażliwym okresie.
3. Ekspozycja na działanie pola magnetycznego BEMER nie spowodowała zwiększenia wrażliwości zarodków na embriotoksyczne działanie podprogowych dawek cyklofosfamidu - leku o dobrze znanych właściwościach teratogennych.



Po wszelkie informacje zadzwoń lub napisz:

Mariusz Ostachowski

telefon 0 602 33 55 11

mail rubikon@home.pl

Tel. stacjonarny: 058 5527530

do_gory Góra strony